动物病原微生物宏基因组高通量测序技术规范专家共识（2024版）

通讯作者：田克恭 国家兽用药品工程技术研究中心，洛阳 471003原霖 北京中科基因技术股份有限公司，北京 1026291动物病原微生物宏基因组高通量测序技术规范专家共识（2024 版）中国兽医协会兽医实验室检测分会【摘要】宏基因组高通量测序技术作为一项新兴的、通用的微生物检测工具，可以识别所有微生物，在动物病原微生物临床检测中发挥了重要作用，被广泛应用于动物多病原检测、未知病原诊断、疫病流行病学调查、病原溯源等多种场景。但在兽医检测行业，宏基因组高通量测序技术尚未形成一致性、规范性认识。本文从实验室建设及管理、实验操作、生物信息学分析、结果判定、质量控制、报告审核等方面阐述了宏基因组高通量测序技术在动物病原微生物临床检测中应用的专家共识，并提出规范性要求和建议。【关键词】宏基因组高通量测序技术；动物病原微生物；专家共识过去几十年来，禽流感、非洲猪瘟、口蹄疫等动物传染病给畜牧业造成了重大损失，同时动物来源的传染病病原体对食品安全和公共卫生健康构成了严重的威胁。据世界卫生组织报告，全球新发传染病中约有 60%的传染病和 75%的新兴人类病原体来自动物。有效监测、控制动物病原微生物的发生对维护人类、动物和生态系统“同一个健康”2至关重要。微生物高通量测序（High-throughput Sequencing, HTS）方法主要包括全基因组测序、宏基因组测序、靶向测序。其中，宏基因组高通量测序技术不依赖于传统的微生物培养，无需特异性扩增,直接对临床样品中的核酸进行高通量测序，通过与数据库进行比对分析，根据比对到的序列信息来判断样品包含的病原微生物种类，能够快速、客观地检测临床样品中的所有微生物[1]。宏基因组高通量测序技术可用于动物及动物产品（动物源性食品、疫苗、饲料、生物材料、培养物或分离物等）中的微生物（包括病毒、细菌、真菌、寄生虫、放线菌、衣原体、支原体、立克次体、螺旋体）测序，适用于二代和三代高通量测序平台[2]。世界动物卫生组织（World Organization for Animal Health，WOAH）陆生动物诊断测试和疫苗手册推荐了高通量测序技术在动物病原微生物检测上的应用场景及检测目的：（1）可用于检测生物材料（如诊断或监测样品）、培养物或分离物中的感染因子及其特征；（2）也可以作为一种确诊方法，确认在其他初筛中检测到的生物，或提供其他特征分析；（3）检测、鉴别此前从未鉴定过的微生物，并进行特征分析；（4）提高已知疫病的诊断水平；（5）提高由已知或未知病原造成的新发或再发疫病的诊断水平；（6）开发单一的“通用”诊断技术，鉴定任何潜在病原体；（7）对于多因子混合感染的疫病，同时快速检测多种病原体；（8）在农场、地方、国家和全球等层面，提高研究病原体进化动力学的能力；（9）更深入地了解传染病的流行病学和感染因子的亲缘地理学；（10）加强传染病和病原体传播模式的可追溯性，包括在法医流行病学中的应用；（11）3更全面地了解已知病原“群体”（如相关次要流行株、逃逸变异株等）的特性，有助于开发更好的疫苗、抗病毒制剂等；（12）通过对一个病原体的多个毒/菌株（包括参考株）进行全基因组测序，更好地建立起病原基因型和表型之间的关联。现在我国尚未出台动物病原微生物宏基因组高通量测序技术应用的规范性标准，国内部分兽医实验室建立了各自的宏基因组高通量测序平台，但还没有形成行业内规范性、系统性、一致性的认知。为了满足兽医临床测序需要，本共识将对如何开展动物病原微生物宏基因组高通量测序提出具体的指导性意见。1 实验室建设基本要求1.1 生物安全要求宏基因组高通量测序的动物种类和病原微生物种类范围广泛，可能存在高致病性病原微生物，开展动物病原微生物宏基因组高通量测序的实验室应具备生物安全二级（biosafety level 2，BSL- 2）及以上的条件和相关资质，并严格按照农业农村部要求及相关法律法规进行实验操作[3-9]。1.2 实验室结构布局宏基因组高通量测序整个流程通常分为湿实验和干实验两部分[10]。湿实验流程是指从样品处理到测序数据产生的整个过程，需要在标准的实验室完成，一般包括：样品前处理、核酸提取、文库制备、测序；干实验流程是指对测序数据进行生物信息学分析及结果审核和出具报告的过程。宏基因组高通量测序湿实验的每一个环节都要严格控制气溶胶污染。实验室具备的基本功能区域应包括：体系配制室、样品处理室、核4酸提取室、文库制备室、测序室，各实验室应配备能满足实验需求和质量控制要求的实验设备，人员、试剂和耗材应单向流动。1.3 人员配置实验室要求相关工作人员必须具有相应专业背景和专业技能，包括：湿实验要求实验人员应具备分子生物学和微生物学专业技能，保证实验规范性操作；数据信息分析人员应具备生物信息学专业技能；结果和报告审核人员应具备动物医学专业背景和兽医临床经验。所有人员均须通过岗位相关的培训和考核方能上岗[3,7-9]。1.4 测序平台高通量测序技术包括第二代测序技术（next generation sequencingtechnique，NGS）和第三代测序技术（third generation sequencing technique，TGS）。NGS 以 DNA 纳米球测序和边合成边测序技术为主，测序数据量大，准确性高，测序成本低，但测序读长较短，拼接复杂、长基因组时较困难；TGS 以纳米孔测序和单分子荧光信号测序两种技术为主，测序读长长，可拼接长基因组序列，但数据产出量较低，准确性较低、测序成本较高，可实时产出数据，设备可便携[2]。各实验室可根据自身测序样品数量、测序长度、准确度、数据量、时效性和测序成本等因素选择适合的测序方法和测序平台。2 实验操作2.1 样品采集及制备样品质量和适用性直接影响动物疫病的宏基因组高通量测序实验结果[3]。因此，样品采集应尽量选择感染部位的体液或新鲜组织，以提高5测序的灵敏度。采集过程中应执行无菌操作，避免样品被污染。样品采集过程中应使用无菌采样管、采样袋等无菌采样，每个样品须单独保存，在包装外标记清楚样品编号、样品名称、物种来源、采样日期、采样地点、送检人名称及联系方式、送检单位、病例信息及测序目的等信息[3]。表 1 部分样品采集注意事项表样品类型样品采集量储存条件采样说明全血1 mL 以上4 ℃保存使用一次性无菌采血管进行采集组织5 g 以上-20 ℃保存一周或-80 ℃长期保存推荐无菌采集病死动物具有明显病变与健康组织交界处的肺脏、脾脏、淋巴结等实质脏器；采集肠道组织时应选择病变明显的肠管连同内容物一同结扎取样口鼻拭子1 mL 以上使用专用无菌采样拭子进行采样唾液1 mL 以上使用一次性无菌注射器或采样管进行采样乳汁10 mL 以上建议采集中段奶脓液1 mL 以上使用一次性注射器无菌采集脓肿内部脓液流产物5 g 以上推荐无菌采集流产胎儿、胎盘、胎衣等流产物粪便5 g 以上建议采集新鲜粪便培养物1 mL 以上细菌、病毒培养物需灭活后再送检样品采集后应以最快最直接的方式送往实验室，运输过程中需使用低温容器，以免发生核酸降解，并防止样品泄漏和污染。若无法及时送检，应按规定条件进行保存。在动物疫病领域，样品类型复杂，不同样品类型需要采用不同的前6处